摘 要：目的：用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系。方法：通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计，筛选出p100基因的RNAi有效靶序列，进一步合成靶序列的OligoDNA并构建pLKO．3G—p100I慢病毒载体，用双酶切及测序进行鉴定。将构建好的p100shRNA表达质粒与熳病毒包装质粒共转染至包装细胞293T，包装产生病毒颗粒。运用病毒颗粒感染HepG2细胞，获得p100稳定沉默的细胞系。荧光显微镜下观察感染效率，利用Westernblot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果。结果：成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体，并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株。慢病毒感染HepG2细胞后，荧光显微镜下观察到90％以上细胞发出绿色荧光，Westernblot证实干扰p100后，HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低。结论：成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系。 |
